Методы изучения жизни на молекулярном уровне

Реферат на тему:

Некоторые представления о биохимии живой клетки

К середине XX века биохимия добилась выдающихся успехов в изучении живых объектов на молекулярном уровне, то есть на уровне химических реакций, обеспечивающих жизнедеятельность. Эти успехи вооружили медицину способами диагностики заболеваний и контроля за их течением посредством химических анализов крови, мочи, желудочного сока и других выделений организма человека. В этих жидкостях определяли содержание интересующих врача сравнительно небольших молекул или суммарного белка.

Что же касается создания лекарств, то здесь в основном приходилось исходить из многовекового опыта человечества по использованию лекарственных растений. Процесс поиска нового лекарства начинался с идентификации химического соединения, играющего лечебную роль в составе апробированного растения. Далее следовала разработка методик лабораторного синтеза этого соединения и его аналогов и оценка лечебного действия каждого из полученных таким образом веществ. Нередко синтезированные аналоги оказывались намного эффективнее, чем экстракты из исходных растений. Однако вся фармакология продолжала опираться только на лечебную практику, обеспеченную самой природой. В некоторых, иногда редких, а иногда и очень частых случаях заболеваний (например, раковых) природное обеспечение способов лечения отсутствовало, и медицина оказывалась бессильной. Стало ясно, что подлинная революция в ней произойдет в результате понимания на молекулярном уровне всего множества сложных химических процессов, идущих в живой клетке. Тогда откроется перспектива целенаправленной корректировки этих процессов с помощью химических соединений, синтезированных в лаборатории на основе такого понимания.

Попробуем вкратце рассмотреть некоторые представления о биохимии живой клетки, как они сложились к началу 50-х годов прошлого столетия прочную «третичную структуру» фермента, так и расположение каталитического, или, как говорят, «активного» центра на поверхности его глобулы. Наконец, что же может представлять из себя сам активный центр? Да ничего иного, кроме строго фиксированного пространственного расположения все тех же свободных и химически активных групп атомов аминокислот, поскольку ничего другого в составе белка, как правило, нет. Скольких аминокислот? Ниже мы увидим, что химическая структура всех аминокислот такова, что любая из них имеет только одну потенциально активную и свободную химическую группу. Силы связывания субстратов ферментативной реакции в активном центре должны быть невелики — ведь продукты реакции должны иметь возможность легко его покинуть. Разумно было предположить, что для удержания субстратов в активном центре на время протекания каталитической реакции достаточно трех-пяти слабых связей. Это означает, что в состав активного центра входит такое же количество аминокислот. Они (так же, как связующие глобулу аминокислоты) могут принадлежать к весьма удаленным друг от друга звеньям белковой цепи фермента, оказавшимся рядом на его поверхности. Мало того. Пространственное расположение активных групп этих аминокислот должно оказаться строго определенным для того, чтобы соответствовать пространственной конфигурации молекулы субстрата (или субстратов).

ДНК — двунитевые полимеры (у человека)

Не менее значительные успехи были достигнуты и в понимании механизма наследственности. Еще в 40-х годах господствовало мнение, что ее обеспечивают специальные белки. Затем было убедительно показано, что за сохранение и передачу потомству всех признаков вида (а также индивидуальных особенностей родителей, если процесс размножения двуполый) отвечает особое вещество — дезоксирибонуклеиновая кислота («ДНК»). У бактерий это вещество содержится в цитоплазме, а иногда еще в особых образованиях — кольцевых «плазмидах». У более высоко организованных существ — в клеточном ядре и (немного) в мито-хондриях. ДНК тоже оказались удивительно близкого элементарного химического состава у всех живых организмов. Физические свойства очень вязких водных растворов ДНК показали, что это гигантские молекулы, масса которых у высших организмов достигает нескольких сотен миллиардов дальтон и даже у бактерий измеряется миллиардами дальтон.

Для сопоставления имеет смысл представить таблицу размеров (число пар оснований) и молекулярных масс (в дальтонах) ДНК из разных источников.

Организм

Пар оснований

Дальтон

Млекопитающие

3 • 10⁹

1,9•10¹²

Дрозофила

1,2 • 10⁸

7,7•10¹⁰

Дрожжи

1,6 • 10⁷

1 • 10¹⁰

Е. coli («кишечная палочка»)

4 • 10⁶

2,5• 10⁹

Бактериофаг Tg

2 • 10⁵

1,3• 10⁸

Бактериофаг

4,8 • 10⁴

3 • 10⁷

Плазмилы

PBR 322

4363

2,8• 10⁶

PUC18

2686

1,7- 10⁶

Молекулы ДНК оказалось возможным даже «увидеть» с помощью электронного микроскопа. Они выглядят как очень длинные и тонкие «нити». Эти нити удалось расщепить на образующие их сравнительно низкомолекулярные составляющие — «нуклеотиды» (М= 320 дальтон). Таковых оказалось всего четыре типа. Структура нуклеотидов подсказывала, что они, подобно аминокислотам в белке, связываются между собой химически одинаковыми («фосфодиэфирными») связями в одномерные цепи. С учетом соотношения молекулярных весов ДНК и нуклеотидов эти цепи могут насчитывать более миллиона звеньев у бактерий и около 3-х миллиардов у человека. Вся наследственная информация должна содержаться («быть записанной») в такой цепи. Единственно возможный способ «записи» представляет собой определенное чередование четырех нуклеотидов. Этот способ не покажется недостаточным, если мы вспомним, что азбукой Морзе (чередование тире и точек) можно записать, к примеру, «Войну и мир».

Передача наследственной информации означает, в первую очередь, задание «первичной» структуры всех белков данного организма. То есть определение всей уникальной последовательности 20-ти аминокислот в цепи каждого из них. Отсюда вытекает необходимость «генетического кода». Четыре определенным образом чередующиеся нуклеотида должны однозначно определять положение каждой аминокислоты в цепи белка. Для этого необходимо использовать, как минимум, двадцать (по числу аминокислот) различных комбинаций из стоящих подряд нуклеотидов. Если предположить, что каждую аминокислоту будет определять последовательность четырех (любых) нуклеотидов, то таких возможных комбинаций окажется 256. Это — слишком много. Если бы «кодирующую» комбинацию образовывала последовательность двух нуклеотидов, то возможных комбинаций оказалось бы слишком мало — всего 16. Остается единственный вариант «кодирующей тройки» (триплета) нуклеотидов. Из четырех элементов можно образовать 64 различных комбинаций по три. Такие комбинации получили название «кодонов» в составе ДНК. Генетический код оказывается избыточным или, как говорят, «вырожденным». В среднем на каждую аминокислоту приходится по три возможных кодона (впрочем, распределение может и не быть равномерным). Такая избыточность еще не вносит столь катастрофической неопределенности, какую бы породили 256 комбинаций «кодирующих четверок». Однако в середине прошлого века концепция трехчленного генетического кода была не более, чем рабочей гипотезой.

В 1953 г. произошло важное событие в истории биологической науки. На основе результатов рентгеноструктурного анализа ДНК Уотсон и Крик достаточно убедительно показали, что ее «нативные» молекулы представляют собой не одну, а две параллельно идущие цепи, связанные между собой относительно слабыми связями (при нагревании раствора ДНК до 90 °С или при обработке 0,3 М NaOH эти цепи разделяются — молекула ДНК «денатурирует»). Анализ химической структуры нуклеотидов показывал, что такого рода «спаривание» цепей возможно посредством относительно слабых «водородных связей» между нуклеотидами, находящимися в двух «комплементарных» цепочках ДНК. (С такими связями мы познакомимся немного позже). За спаривание цепей ДНК «отвечают» химически активные группы в нуклеотидах. Это обеспечивает сохранность структуры всей молекулы ДНК, а значит и записанной в ней наследственной информации в течение всего времени жизни клетки. Ввиду различия пространственных размеров нуклеотидов (два из них крупнее, чем два других) условие параллельности цепей исключало возможность спаривания двух одинаковых нуклеотидов, а только одного из крупных с одним из малых в каждой паре. Это означало, что последовательности нуклеотидов в спаренных цепях ДНК не могут быть одинаковыми. Отсюда, в свою очередь, вытекало предположение, что если одна из цепей ДНК несет в себе информацию для синтеза белка (назовем ее «значащей» или «кодирующей» цепью), то вторая — выполняет только защитную функцию. В начале 50-х годов ученые еще не представляли себе механизма «считывания» наследственной информации с ДНК и передачи ее в систему белкового синтеза. Тем не менее, было ясно, что этот механизм должен быть связан с полным или локальным освобождением значащей цепи ДНК от ее «защиты».

«Двунитевая» структура ДНК подсказывала и удобную модель ее «редупликации» — удвоения количества ДНК перед делением клетки, при условии сохранения всей наследственной информации в каждой из дочерних клеток. Предполагалось, что две нити ДНК расходятся и каждая из них служит «шаблоном» для «комплементарного» (дополнительного) синтеза второй нити. Комплементарность в этом случае означает более строгое требование: не просто постановку в новосинтезируемой нити крупного нуклеотида против мелкого, но однозначность пар нуклеотидов. То есть для четырех нуклеотидов, которые пока обозначим А, В, С и D, в силу их химического строения оказывались возможными только две пары, например, А—В и С—D. Нетрудно сообразить, что в этом случае по шаблону кодирующей нити будет синтезироваться защитная нить, точно такая, как в исходной молекуле ДНК, а по шаблону защитной нити будет синтезироваться полноценная кодирующая нить. Если при этом обе новообразованные пары нитей останутся комплементарно связанными, то они окажутся точными копиями «материнской» двунитевой ДНК.

Эта красивая (и, как потом убедились, верная) гипотеза тут же натолкнулась на, казалось бы, непреодолимое возражение. Дело в том, что результаты рентгеноструктурного анализа, расшифрованные Уотсоном и Криком, совершенно определенно указывали еще и на то, что двойные нити ДНК свернуты в довольно плотные спирали с шагом в 3,4 миллимикрона при диаметре спирали -2 миллимикрона. Для того, чтобы разъединить две нити ДНК очевидно надо было бы сначала раскрутить спираль, насчитывающую сотни тысяч, а то и сотни миллионов витков. (В каждый виток укладывается десять пар нуклеотидов.) Трудно вообразить себе каким образом такая спираль может быть раскручена.

РНК — однонитевые полимеры с массой до 4 миллионов дальтон

В начале 60-х годов появились и первые сведения об участниках самого процесса белкового синтеза. В цитоплазме клеток были обнаружены молекулы рибонукленовой кислоты («РНК»), очень похожие по своему составу и строению на ДНК. Они представляют собой тоже цепочки чередования четырех нуклеотидов — таких же, как в ДНК, за исключением одного из них, впрочем, отличающегося лишь незначительно. Главное отличие заключается в том, что в состав нуклеотидов ДНК входит некий «сахар» — дезоксирибоза, а в нуклеотидах РНК его место занимает рибоза, имеющая на одну ОН-группу больше.

Часть молекул цитоплазменных РНК оказались довольно крупными и нестабильными («короткоживущими»). Притом определенно однонитевыми. Поскольку в клетке синтез одних ферментов может сменять синтез других (рост, изменение питания и пр.), в этих нестабильных молекулах РНК заподозрили переносчиков наследственной информации от ДНК к белку. Их назвали «информационными» (иРНК). Гипотеза о механизме редупликации ДНК подсказывала возможный способ считывания и переноса этой информации. Можно было предположить, что на участке ДНК, кодирующем синтез определенного белка (на участке «гена»), по шаблону нити, которую мы ранее назвали «защитной», синтезируется молекула иРНК. Очевидно, что последовательность нуклеотидов в ней будет точно повторять последовательность кодирующей нити. Таким образом, информация на синтез определенного белка перейдет на иРНК, и вместе с ней может быть из ядра перенесена в цитоплазму. Разумеется, в этом случае нити ДНК тоже должны разойтись, хотя бы на участке гена.

Кроме крупных молекул иРНК (ген может насчитывать несколько тысяч нуклеотидов) в цитоплазме были найдены малые (длиной менее сотни нуклеотдиов) и стабильные молекулы РНК. Им приписали роль переносчиков аминокислот к месту синтеза белка и потому назвали «транспортными» (тРНК).

Само место синтеза были основания связать с обнаруженными в цитоплазме с помощью электронного микроскопа довольно крупными, — порядка 25 тр. в диаметре, — частицами, которые были названы «рибосомами». (В их составе оказались и белки, и какие-то еще специфические РНК.) Однако до ясного понимания механизмов ферментативного катализа, редупликации ДНК и белкового синтеза было еще очень далеко.

Впрочем, одно поразительное открытие было уже сделано. Хотя описанные выше представления об основных процессах жизнедеятельности еще были только рабочими гипотезами, обоснование этих гипотез можно было с равным успехом почерпнуть из изучения любых живых организмов от бактерий до человека. Во всех случаях белки, ДНК и РНК имеют примерно одинаковый элементарный состав и представляют из себя одинаково построенные цепи соответственно из 20-ти свободно чередующихся аминокислот или 4-х нуклеотидов. Даже размеры белков, несмотря на различие размеров целых организмов, оказались одного порядка величины. (Чего нельзя сказать о ДНК, что и понятно, поскольку необходимое количество наследственной информации напрямую связано со сложностью организма). Было показано, что целый ряд ферментов, катализирующих одни и те же реакции в клетках высших и низших организмов, по своим физическим и химическим параметрам похожи друг на друга. И даже порой оказывались взаимозаменяемыми в реакциях, осуществляемых «in vitro» (в пробирке). Имелись также достаточные основания предполагать, что редупликация ДНК и синтез белка в любых живых клетках происходят сходным образом. Природа оказалась очень экономной в отборе средств реализации жизни!

Все изложенное выше показывает, что хотя к середине прошлого века наука о молекулярной природе жизни («молекулярная биология») достигла немалых успехов, перед ней встал целый ряд трудных проблем. Для понимания работы ферментов надо было найти способы выделения и очистки индивидуальных белков, затем расшифровать всю последовательность образующих эти белки аминокислот. Для каждого из ферментов определить его пространственную структуру, состав и конфигурацию активного центра. Для проверки гипотезы генетического кода необходимо было найти способы тщательной очистки ДНК, определения последовательности нуклеотидов в ней и границ генов. Еще более сложные задачи предстояло решить для понимания механизмов редупликации ДНК, считывания наследственной информации, зашифрованной в генах, способа передачи ее к местам синтеза белка (рибосомам?) и, наконец, самого механизма этого синтеза, управляемого последовательностью кодирующих троек (?) нуклеотидов в гене. При этом следовало ожидать обнаружения целой гаммы специальных ферментов и регуляторных факторов, осуществляющих все эти процессы. Их предстояло выделить, очистить и всесторонне охарактеризовать.

Вскоре стало ясно, что для разрешения этих сложных проблем арсенала чисто химических методов исследования явно недостаточно. Биологам и биохимикам необходимо было воспользоваться современными физическими методами исследования. Такими, как электрофорез, ультрацентрифугирование, гель-фильтрация, жидкостная хроматография, использование флуо-ресцентных меток, радиоактивных изотопов, рентгеноструктур-ного анализа. Все это — названия тем и разделов предлагаемого курса. Исторические обстоятельства сложились так удачно, что как раз в начале 50-х годов многие выдающиеся физики, не желавшие из гуманных соображений продолжать работать в области совершенствования атомного оружия, пришли в биологию. Этот процесс начался в США и вскоре продолжился в Западной Европе и Советском Союзе.

Историю развития физических методов исследования в биологии за вторую половину XX века можно условно разбить на два этапа, 1-й этап — до 1980 года. В это время физические методы развивались и модифицировались для нужд молекулярной биологии. Количества исходного биологического материала, которые требовались для применения этих методов, измерялись граммами или, в лучшем случае, миллиграммами, 2-й этап — с 1980 г. до конца века. Бурное развитие «генной инженерии», как методического подхода, потребовало перехода на работу с микрограммовыми количествами биологического материала. А также — автоматизации и роботизации рутинных исследований, требующих подчас одновременного проведения сотен однотипных операций. Для обработки тысяч экспериментальных данных были созданы специальные компьютерные программы.

Плодотворное использование в биологических экспериментах современных физических методов не терпит бездумного копирования описанных в научной литературе процедур. Результаты, получаемые этими методами, слишком сильно зависят от выбора биологического объекта, качества химических реактивов, рабочих характеристик имеющихся в наличии приборов и множества других объективных факторов. Для их учета и осмысленного выбора условий эксперимента необходимо понимание физической сущности каждого используемого метода.

Методы изучения жизни на молекулярном уровне

Похожие курсовые работы